Tìm hiểu về kính hiển vi

Kính hiển vi đã thay đổi rất nhiều so với năm 1986, từ kính hiển vi huỳnh quang confocal cho tới kỹ thuật hình ảnh độ phân giải siêu lớn và 3-D thực.

su-phat-trien-cua-kinh-hien-vi-theo-thoi-gian-2-3

Vào năm 1983, Ersnt Stelzer tham gia vào phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Châu Âu (EMBL) ở Heidelberg, Đức để theo đuổi hướng nghiên cứu tiến sĩ của ông trong lĩnh vực động học protein màng. Ngay sau đó, ông tham gia vào một dự án có tên là phát triển kính hiển vi huỳnh quang confocal đầu tiên. Stelzer và các cộng sự đã thiết kế một thiết bị có một lỗ ngắm (pinhole) để loại bỏ những lớp tia laser bị sai nét để tạo ra “lát cắt quang học – optical section” mỏng – trái ngược với các lắt cắt vật lý của một mẫu dày. Đây là lần đầu tiên chúng ta có thể nhìn cấu trúc mô ba chiều.

Stelzer kể lại rằng để chụp bốn bức hình tế bào thận của chuột, ông đã phải mất một ngày. Hơn thế nữa, để chuẩn bị mẫu và quan sát toàn bộ mẫu bằng kính hiển vi, ông phải chuyển những hình ảnh thu được từ bộ nhớ trong của kính hiển vi vào đĩa mềm và máy quét, cuối cùng là máy in. Mặc dù công việc này khá khó khăn, nhưng các thiết bị tự chế cũng nhanh chóng trở thành công cụ chính trong phòng thí nghiệm Stelzer và các đồng nghiệp tiếp tục dành nhiều năm sau đó cho việc chụp ảnh các cấu trúc và quá trình trong tế bào, ví dụ như cấu trúc vi ống, quá trình sinh tổng hợp và vận chuyển lipid trong tế bào thận, các liên kết của các tế bào cơ.

Stelzer tiếp tục hợp tác với tập đoàn Zeiss để xây dựng các thiết bị thương mại confocal đầu tiên, và cho tới giữa những năm 1990, kỹ thuật này bắt đầu được chấp nhận sử dụng rộng rãi, cho phép hiển thị hình ảnh cấu trúc 3-D mà kính hiển vi quang học truyền thống không thực hiện được.

Kính hiển vi confocal là sự bắt đầu của cuộc cách mạng về hình ảnh, sau đó là các kỹ thuật có độ phân giải siêu cao giúp cải tiến hình ảnh 3-D của mẫu vật sống. Giờ đây, những phương pháp này đã giúp các nhà sinh học nhìn thấy và hiểu rõ hơn các chi tiết nhỏ nhất của sự sống – và nó cũng là công cụ giúp cho sự phát triển.

Đạt tới các giới hạn vật lý

Kính hiển vi đầu tiên được phát triển vào thế kỉ 17 ở Hà Lan, với những đóng góp đáng kể từ nhà sản xuất ống kính người Hà Lan Antonie van Leeuwenhoek- công cụ có độ phân giải ở 1 micro mét. Trong năm 1873, nhà vật lý Ernst Karl Abbe tìm ra độ phân giải của một kính hiển vi bị giới hạn bởi sự nhiễm xạ của tia sáng khi đi xuyên qua ống kính, ông đã hợp tác với nhà chế tạo các thiết bị quang học Carl Zeiss (nhà sáng lập Công ty Zeiss) và nhà sản xuất kính Otto Schott để chế tạo kính hiển vi có thể cho độ phân giải đạt tới giới hạn lý thuyết – khoảng 200 nano mét, hay 0.2 micro mét.

Khi Betzig nhập học năm 1982, ông chế tạo một kính hiển vi có độ phân giải tăng 12 nano mét bằng cách truyền tia sáng thông qua một lỗ nhỏ hơn bước sóng ánh sáng. Thiết bị này dễ bị mất nét khi mẫu dày hơn 20 nano mét, vì vậy, Betzig cần phải chuẩn bị mẫu cho phù hợp. Lúc đó, Stefan Hell – tốt nghiệp Đại học Heidelberg và tham gia chương trình hậu tiến sĩ ở EMBL, và cuối cùng nhóm của ông ở Viện Max Planch cũng đã cố gắng phá vỡ giới hạn về nhiễu xạ, bằng cách tăng năng lượng cho các phân tử huỳnh quang đã được kích thích để ép phân tử đó xuống trạng thái năng lượng thấp, làm giảm tín hiệu nền bằng các phân tử làm tắt huỳnh quang từ những đối tượng liền kề với các vùng quan tâm. Hell kể lại trong một email “Trong những ngày này, các nhà khoa học tin rằng nó sẽ không thành hiện thực. Tôi rất tò mò nếu nó có thể thì sao?”.

Nhóm của Hell đã thành công lần đầu tiên. Vào năm 2000, các nhà nghiên cứu giới thiệu phương pháp cao năng lượng là loại bỏ phát xạ kích thích (STED). Các kính hiển vi sử dụng một chùm hẹp tia sáng để kích thích một phần nhỏ trong mẫu, đồng thời chiếu một vòng tròn quanh chùm hẹp để dập tắt huỳnh quang xung quang, thu hẹp khu vực được chiếu sáng. Đây là phương pháp quang học đầu tiên giúp vượt qua giới hạn nhiễu xạ của các mẫu sinh học, cho hình ảnh rõ ràng giữa hai cấu trúc cách nhau 20 nano mét- STED “Thay đổi hoàn toàn suy nghĩ của chúng ta về khả năng thực sự của kính hiển vi”.

Sáu năm sau, Betzig cũng chế tạo một kính hiển vi có độ phóng đại lớn hơn giới hạn nhiễu xạ Abbe 200 nano mét. Để làm được điều này, ông đã sử dụng khám phá của William Moerner về các loại GFP có thể bật và tắt bằng các tia sáng bước sóng khác nhau. Betzig gọi nó là Kính hiển vi kích thích ánh sáng theo vùng (PALM), lợi dụng sự khác biết giữa tỉ lệ các phân tử bật/ tắt để phân biệt chúng và xác định vị trí chính xác từ rất nhiều hình ảnh chồng lên nhau; phương pháp này có độ phân giải tương tự như STED. Betzig, Moerner và Hell cùng chia sẻ giải Nobel Hóa học 2014cho những cải tiến độ phân giải của kính hiển vi hay siêu hiển vi của họ.

Tấm ánh sáng

Một trong những hạn chế của các kỹ thuật siêu phân giải là có thể phá hỏng mẫu khi sử dụng năng lượng lớn trực tiếp lên nó. Betzig nói “STED cần một lượng ánh sáng lớn gấp triệu lần lượng ánh sáng tế bào cần để tồn tại”. Hell đã giải quyết được vấn đề này với RESOFT, là dạng biến đổi của STED sử dụng ánh sáng năng lượng thấp hơn. Các nhà khoa học cũng đã tạo ra các phương pháp “dễ chịu” hơn nhưKính hiển vi minh họa cấu trúc (SIM). Hình ảnh thu được có thể gộp lại và có độ phân giải tăng gấp đôi giới hạn Abbe, và đặc biệt là SIM “không đốt cháy mẫu của bạn tại chỗ như kỹ thuật confocal” Rainer Heintzmann cho biết.

Vì những kỹ thuật confocal năng lượng thấp này có thể phá hủy tế bào, do đó với những hình ảnh mô thực cấu trúc ba chiều theo thời gian dài, các nhà khoa học sẽ chuyển qua sử dụng kính hiển vi tấm ánh sáng, trong đó các tia sáng chiếu qua mặt bên của mẫu vuông góc với bộ phận dò. Năm 2004, Stelzer đã phát triển kính hiện vi minh họa mặt phẳng chọn lọc (SPIM), một kỹ thuật có độ phân giải dưới mức tế bào, và đã được dùng để quan sát trực tiếp mô của cá và ruối giấm. Vì SIPM phơi mẫu với năng lượng thấp hơn nhiều lần so với các kỹ thuật khác nên việc chụp ảnh mẫu không làm ảnh hưởng sức sống của con non. Gần đây, Betzig giới thiệu kính hiển vi tấm ánh sáng rèm, giảm năng lượng trực tiếp trên mẫu bằng cách kết hợp SPIM và SIM, minh họa mẫu bằng mô hình ánh sáng thay vì tấm sáng.

su-phat-trien-cua-kinh-hien-vi-theo-thoi-gian-4-1